如何有效去除填料上的多种常见杂质并进行储存

经常有小伙伴来电咨询智荟专线，是否有一种清洗试剂，能够同时有效去除填料上的各种杂质，常见的如蛋白、脂类、核酸、病毒等等？没错，答案是氢氧化钠。

氢氧化钠被广泛用于填料的清洗、消毒和储存。使用氢氧化钠的一大好处在于高效、低成本，并且易于检测、清除。氢氧化钠一直被认为能够有效去除蛋白和核酸、皂化脂类，同时还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素，清洗效率高且普适性广泛。当然，必须考虑到层析介质、层析系统以及辅助部件与使用的氢氧化钠浓度、时间以及使用温度的兼容性，还需注意氢氧化钠对金属和皮肤具有一定的腐蚀作用 ^[1]。

氢氧化钠被广泛用于清除结合在离子交换、疏水以及凝胶过滤填料中的蛋白。由于亲和层析填料大多数的配基通常比较脆弱，不能耐

受过于剧烈的环境， 因此需要降低使用的氢氧化钠浓度。近些年，Cytiva最新开发的新一代Protein A亲和层析填料改变了这一事实。在

纯化单克隆抗体的工艺中，层析填料与氢氧化钠的兼容性已经得到了明显的改善，MabSelect PrismA是一种更加耐碱的Protein A配

基，可以耐受高达1 M氢氧化钠作为清洗试剂。

核酸可以与阴离子交换填料紧密结合。实验证实，经过1 M氢氧化钠和3 M氯化钠1小时的清洗，可以有效清除结合在弱阴离子交换

填料DEAE Sepharose Fast Flow上的经过放射标记的小牛胸腺DNA，不过仍有小部分DNA顽固地结合在填料上。

进一步的实验发现，1 M氢氧化钠和1 M氯化钠联用能有效清除强阴离子交换填料Q Sepharose Fast Flow上结合的DNA，然而这

种清除程度也取决于样品的性质 ^[2]。这些实验中在位清洗的接触时间是2小时，其中一组样品则加入了DNase才彻底清除了阴离子交换填

料上的DNA。

测试表明，0.1 M 氢氧化钠足以灭活小鼠白血病病毒（一种典型的包膜病毒） ^[3]。此外，Q‑One Biotech公司公开了氢氧化钠对于8

种不同病毒进行灭活的数据，该实验分别测试了 0.1 M和0.5 M 氢氧化钠，灭活的动力学数据如表1所示。值得注意的一点是，即便是抗

性较高的无包膜病毒，如犬细小病毒和 SV-40也能够被氢氧化钠灭活。此外，克雅氏病 (CJD) 与牛海绵状脑病（BSE）存在联系的报道

更加引起人们对外来病原的重视，BSE病毒对大多数的处理手段都具有相当强的抵抗力，包括360℃ 烘烤1小时 ^[4,5]，而氢氧化钠可以有

效灭活 BSE 病毒。

表1：0.1 M、0.5 M氢氧化钠对8种不同病毒进行灭活

大量的微生物如酵母和细菌会破坏层析柱和填料的功能，此外，这些微生物还具有一些间接影响，比如阻塞过滤层和其他系统元件，

而且它们还可产生一系列有害物质如内毒素、肠毒素和蛋白酶等。表2展示了氢氧化钠在灭活一系列酵母和细菌方面非常有效，效果取决

于浓度、接触时间和温度。

表2清楚地显示细菌孢子无法彻底被氢氧化钠灭活，当然在GMP生产环境以及严苛的卫生清洁程序下，微生物污染可以被有效降低。

为了针对氢氧化钠难以去除的顽固微生物例如枯草芽孢杆菌，加入乙醇可以增强氢氧化钠的抗菌作用，表3显示0.1 M和0.5 M氢氧化钠添

加20%乙醇后抗菌效果得到了明显加强。

有关层析设备及层析柱的细菌挑战实验，请参考：清洁验证之下游层析设备的设计与选型考量。

表3：氢氧化钠添加20%乙醇对枯草芽孢杆菌的除菌效果

图1展示了氢氧化钠对于溶液中大量内毒素进行灭活的效果。值得一提的是，相对于浓度为0.5 M或者1 M的氢氧化钠，采用

0.1 M氢氧化钠灭活内毒素明显需要更长的接触时间。

图1：氢氧化钠灭活内毒素

Cytiva AxiChrom 层析柱通过了使用 1 M 氢氧化钠清除内毒素的挑战测试 ^[6]。在AxiChrom层析柱装填Sepharose 6 Fast Flow 填

料后，室温下与挑战微生物（E. coli ATCC 8739，10⁶ CFU/mL）孵育 16 至 20 小时，然后再用 1 M 氢氧化钠进行处理。取样测试结

果表明， 1 M 氢氧化钠处理有效降低了层析柱中的内毒素水平，内毒素浓度降低6 log，最终流出液的内毒素浓度低于 0.05 EU/mL，这

也低于美国药典(USP)对注射用水 (WFI) 的要求。这些研究表明，对于内毒素而言1 M 氢氧化钠是一种有效的清洁试剂，同时也表明 

AxiChrom 层析柱的设计能够满足GMP 要求的高洁净标准。

一些细菌菌株会产生对人体有害的外毒素，例如蜡样芽孢杆菌会产生呕吐毒素，此毒素会引起恶心和呕吐，呕吐毒素耐热耐酸且对蛋

白酶不敏感。一旦孢子萌发并开始生长，外毒素可以在适当的环境条件下产生和分泌。实验证明，可以通过两步层析法去除中国仓鼠卵巢

细胞(CHO)生产mAb 过程中产生的杂质呕吐毒素，其中约96% 在 MabSelect SuRe 亲和捕获过程中就得到了去除 ^[7]。 在明确已知填

料接触蜡样芽孢杆菌后，建议使用严苛的清洗条件清洁耐碱的 Protein A 填料，例如使用0.5-1 M 氢氧化钠。

用于清洗和消毒的氢氧化钠浓度主要取决于受污染程度的强弱 ^[7][10]。对于层析填料而言，是否支持严格的清洗条件取决于配基以及

基架等在碱性环境下的稳定性，表4 (本文末尾) 列举了Cytiva部分填料在操作及在位清洗时的pH稳定性范围。

MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX 和 MabSelect PrismA是基于刚性高流速琼脂糖基架以及耐碱蛋白 A配基产生的填料。

MabSelect SuRe 和MabSelect SuRe LX 填料能耐受多达 200 次循环的0.1 M NaOH CIP测试，而MabSelect PrismA 增强的配基耐碱

性使得1 M NaOH 清洁填料变为了现实。图 2A展示了MabSelect PrismA、 MabSelect SuRe 和MabSelect SuRe LX 使用 0.5 M 

NaOH 作为清洗试剂循环反复后相对的剩余动态结合载量数据，MabSelect PrismA 在超过300 次循环后依然保留了其初始动态结合载

量的 93%，而图 2B 所示，MabSelect PrismA 在 150 次 1 M NaOH 循环清洗后仍能保留其初始动态结合载量的 90%，MabSelect 

SuRe LX在同等条件下仅能保持50%的初始动态结合载量。

图2：相对的动态结合载量，(A) 填料使用0.5 M NaOH 进行 15 分钟/循环清洗 ，300 次循环；(B) 填料使用 1 M NaOH 进行 15 分钟/循环清洗，150 次循环

氢氧化钠和其他消毒剂相比，价格相对便宜。作为一种抑菌剂，氢氧化钠也被推荐作为储存溶液。根据PDA生物技术清洁认证委员

会的报导，0.1-1 M的氢氧化钠通常可用来保存层析柱 ^[8]。通过简单的在线pH和电导测定即可判断氢氧化钠是否去除干净，而且处理氢

氧化钠废液相对容易，不需要特殊的手段。

大多数层析填料保存在20% 乙醇中，部分填料保存也可以使用2% 苯甲醇 ^[9]，对于某些阳离子交换填料以及复合模式填料如Capto 

MMC ImpRes ，储存时还需补充0.2 M 醋酸钠用于维持pH稳定性。有效期的检测仅针对未开封使用的填料，Cytiva无法针对已经使用

的填料定义其储存时间，因此建议客户根据自身工艺在填料保存后进行载量测试或其他相关测试来完成寿命验证。

表4：使用和在位清洗时填料pH 稳定性范围以及推荐的储存溶液